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            云南紅豆杉葉斑病病原菌的星散判定和生物學(xué)特征

            導(dǎo)讀

            云南紅豆杉(TaxusyunnanensisChengetLu)別稱紫杉、赤柏松,屬紅豆杉科喬木,產(chǎn)于云南西北部及西部、四川西南部與西藏東部,是生產(chǎn)紫杉醇的主要樹種[1-3]。云南紅豆杉是集用材、藥用、綠化于一體的珍貴樹種,特別是其紫杉醇含……

            云南紅豆杉(TaxusyunnanensisChengetLu)別稱紫杉、赤柏松,屬紅豆杉科喬木,產(chǎn)于云南西北部及西部、四川西南部與西藏東部,是生產(chǎn)紫杉醇的重要樹種[1-3]。云南紅豆杉是集用材、藥用、綠化于一體的珍貴樹種,特別是其紫杉醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他紅豆杉樹種[4]。紫杉醇具有抗癌活性,云南紅豆杉的野生資本比較少,人工培育紅豆杉是現(xiàn)在獲取紫杉醇較可行、有用的途徑[1,5]。為了更好地保護(hù)野生云南紅豆杉野生資本,大力培育后續(xù)產(chǎn)業(yè),以滿足市場對云南紅豆杉資本的需求,近年來在云南麗江、大理、楚雄和丘北等地成立了云南紅豆杉人工栽植林。由于云南紅豆杉的普遍種植,病害發(fā)生嚴(yán)重,尤其是云南紅豆杉葉片葉斑病現(xiàn)象日趨普遍,影響了樹勢生長及藥用、觀賞價(jià)值。星散與判定病原菌是開展云南紅豆杉抗病防治研究的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)從自然感病的云南紅豆杉上星散純化得到1株對云南紅豆杉具有寄生作用的真菌,利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀測與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方式,對云南紅豆杉葉斑病病原菌舉行了判定,并依據(jù)其形態(tài)特點(diǎn)與培育性狀舉行了開端研究,為云南紅豆杉葉斑病的防治奠基了基礎(chǔ),同時(shí)也為進(jìn)一步了解該病害的發(fā)病紀(jì)律提供了一定的理論依據(jù)。
            1質(zhì)料與方式
            1.1病原菌的星散
            云南紅豆杉葉斑病葉片采自云南省楚雄市西山,用組織星散法星散病原菌,經(jīng)科赫氏法判定其為云南紅豆杉葉斑病的病原,菌株編號(hào)為hongdoushan02。
            1.2病原菌的判定
            1.2.1形態(tài)學(xué)判定利用顯微鏡觀測純化星散到的病原菌,并對其舉行形態(tài)判定。
            1.2.2病原菌rDNA-ITS序列擴(kuò)增和分解用CTAB法提取病原菌全基因組DNA,舉行ITS-PCR擴(kuò)增。引物序列為ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′;ITS5:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR反映系統(tǒng)總體積25μL,反映各因素終濃度為:Taq酶0.02U/μL、引物0.4μmol/L、DNA模板20ng/μL、dNTPs0.4μmol/L、2×PCR反映緩沖液。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,52℃退火45s,72℃復(fù)性45s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)品送北京百泰克生物技術(shù)有限公司測序,所得序列在NCBI上比對,下載與其相似性較高的序列及其近似屬的序列,用BioEdit、ClustalX和MEGA4.1軟件采取NJ法舉行系統(tǒng)分解,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
            1.3生物學(xué)特征研究[6-7]
            1.3.1不同碳源和氮源對菌落生長的影響
            以察氏培育基為基礎(chǔ)培育基,劃分以葡萄糖、甘油、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等量取代其碳源;劃分以硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸、L-苯丙氨酸、牛肉膏、卵白胨取代氮源。每種培育基中劃分接種直徑為5mm的菌塊,25℃恒溫漆黑培育,5d后用“十”字交織法測量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
            1.3.2不同溫度對菌落和分生孢子萌發(fā)的影響
            取直徑為5mm的菌塊接種于察氏培育基中心,劃分在5、10、15、20、25、28、30、32、35、40、45℃漆黑下恒溫培育,5d后測量菌落直徑。用無菌水制備菌懸液,滴于載玻片上,培育條件同菌落培育,24h后鏡檢孢子萌發(fā)率,每次檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
            1.3.3不同pH值對菌落和分生孢子萌發(fā)的影響
            將高壓滅菌后的察氏培育基pH值劃分調(diào)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9倒平板,取直徑5mm的菌塊接種于察氏培育基中心,漆黑條件下25℃培育5d后測量菌落直徑。用0.2mol/L磷酸氫二鈉和0.2mol/L檸檬酸緩沖液將分生孢子懸浮液pH值調(diào)配為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9,置于25℃恒溫箱漆黑培育,24h后鏡檢萌發(fā)率,每次檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
            1.3.4不同光照處理
            取直徑為5mm的菌塊接種于察氏培育基中心,劃分置于24h光照、12h/12h光暗交替、24h漆黑環(huán)境中,25℃培育5d后測量菌落直徑。用無菌水制備菌懸液,滴于載玻片上,培育條件同菌落培育,24h后鏡檢孢子萌發(fā)率,每次鏡檢100個(gè)孢子。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
            1.4不同殺菌劑對菌落生長的影響
            將代森錳鋅、百菌清、敵克松、霜·錳鋅和撲海因用無菌水按其常用倍數(shù)稀釋,每10mL培育基中加入1mL藥液制成含藥液的平板,比較組加入等量無菌水。取5mm菌塊置于察氏培育基平板中心,25℃漆黑培育5d后測量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。
            2效果與分解
            2.1云南紅豆杉病原菌的判定
            2.1.1形態(tài)學(xué)判定
            該病重要發(fā)生在葉部,發(fā)病初期葉片中部出現(xiàn)多個(gè)黃褐色病斑,病斑邊緣玄色,隨著病情的生長,可延伸至整個(gè)葉片,使葉片枯萎死亡。在PDA培育基上,28℃培育6d菌落直徑達(dá)4cm,菌落青灰色相間,圓形、規(guī)則,邊緣整齊,菌絲絮狀,培育一段時(shí)間后可看到培育皿蓋上有水珠;后頭輪紋狀,中心圓褐色,外圍一環(huán)黃色;菌落生長緩慢(圖1)。菌絲有隔,淡褐色,產(chǎn)孢細(xì)胞孔生式產(chǎn)孢,合軸式延伸或有時(shí)不再延伸;分生孢子多串生(向頂系列),有的單生,卵形或倒棍棒形,具喙,淡橄欖褐至橄欖褐色或褐色,滑膩,具橫隔膜及縱向隔膜,大小(2.4~6.2)μm×(2.9~7.1)μm(均勻2.65μm×6.65μm)。分生孢子頂端或喙部,常孔生式發(fā)生新的分生孢子,云云聯(lián)系發(fā)生,形因素枝或不分枝的孢子鏈(圖2、圖3)。

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